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测序机制

Illumina 短读长测序

核心原理：边合成边测序（Sequencing by Synthesis）

  1. 文库构建：将 DNA 随机打断成 200-600bp 片段，两端接上接头（adapter）
  2. 桥式扩增：片段固定在流动槽（flow cell）上，通过桥式 PCR 扩增形成簇（cluster），每个簇 = 同一片段的 ~1000 个拷贝
  3. 合成反应：每轮加入 4 种带荧光标记的可逆终止型 dNTP，掺入一个碱基并成像后，切除荧光基团和阻断基团，再进入下一轮
  4. 读长：NovaSeq X 系列支持包括 2×150 bp 在内的双端测序配置，具体读长和通量取决于流动槽与试剂配置

关键参数

概念 含义
覆盖度（Depth） 每个碱基被测到的平均次数。WGS 通常 30-60×，WES 100-200×
读长（Read length） 每条 reads 的长度，PE150 = 双端各 150bp
插入片段（Insert size） 两个 reads 之间的实际 DNA 片段长度

其他平台

  • PacBio / ONT（长读长测序平台）：适用于结构变异、单倍型和全长转录本等分析
  • 10x Genomics（文库与检测体系）：提供单细胞和空间组学文库制备方案，所得文库通常仍需在兼容测序仪上读取

数据结构与文件格式

整个分析流的数据格式演变：

原始信号 → FASTQ → BAM/SAM → VCF/MAF → 下游分析表

FASTQ — 原始测序数据

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

每条 read 4 行：ID、序列、+、质量值。一个 WGS 样本通常产生数百 GB 的 FASTQ。质量分数为 Phred quality score，编码每个碱基的测序可信度。

SAM/BAM — 比对结果

SAM（文本）和 BAM（二进制压缩）存储 reads 比对到参考基因组的结果。

核心字段：

列 含义 示例
QNAME read 名 SEQ_ID
FLAG 比对状态标志 99 = paired, mapped, proper pair
RNAME 参考染色体 chr1
POS 比对起始位置 10000
MAPQ 比对质量 60
CIGAR 比对操作串 150M = 150bp 完全匹配
SEQ 碱基序列
QUAL 质量值

索引：.bai 文件，支持随机访问任意基因组区间。

VCF — 变异检测结果

存储 SNV、Indel、SV 等变异信息。

#CHROM  POS     ID  REF  ALT  QUAL  FILTER  INFO           FORMAT       SAMPLE
chr1    12345   .   A    G    60    PASS    DP=50;AF=0.5   GT:AD:DP:GQ  0/1:25,25:50:99
  • REF/ALT：参考/变异碱基
  • AF：变异等位基因频率
  • GT:AD:DP：基因型、等位基因深度、总深度

体细胞突变 VCF vs 胚系 VCF：前者只存肿瘤特异突变，后者存个体遗传变异。

MAF — 突变注释格式

VCF 的"扁平化"版本，每行一个突变，已注释好基因、突变类型、临床意义等。TCGA 项目广泛使用。

拷贝数相关格式

  • Battenberg 输出：等位基因特异性拷贝数（major/minor CN per segment）
  • Segment 文件：chr start end total_CN 的分段表

CNV 结果表通常还会给出分段坐标、片段长度、标准化读深和质量统计量，具体字段定义依赖上游软件。

CNV 分段结果字段示例

数据流全景（肿瘤 WGS）

样本 → DNA提取 → 文库构建 → 测序仪
                                ↓
                            FASTQ (原始reads)
                                ↓
                         BWA-MEM 比对
                                ↓
                          BAM (比对结果)
                         ↙        ↘
               突变检测(Strelka2/MuTect2)    拷贝数(Battenberg)
                        ↓                        ↓
                      VCF/MAF              Segment/CN profile
                        ↓                        ↓
                  亚克隆聚类(dpclust/PyClone) ← CCF
                        ↓
                  进化树 + MRCA估计(MutationTimeR)

关键数据结构（代码层面）

结构 语言 用途
GRanges (Bioconductor) R 基因组区间操作（chr:start-end + 元数据）
GAlignments R 读取 BAM 文件
VariantAnnotation R 读取 VCF
pysam Python 读写 BAM/VCF 的 Python 接口
AnnData Python 单细胞数据矩阵（cells × genes）

关联条目

  • 突变特征 — 突变特征分析依赖 VCF 中的 SNV/Indel 数据
  • 肿瘤进化与异质性 — 亚克隆重建依赖 BAM → CCF → 聚类流程
  • DNA 双链断裂修复与同源重组 — DSB 修复缺陷影响突变谱和拷贝数模式

参考资料