📄 CANVAS 空间肿瘤剖析研究 · IDH 突变胶质瘤空间组织研究

概述

CODEX（Co-Detection by indEXing）是一种基于 DNA 条形码抗体与循环荧光读出的多重组织蛋白成像技术，属于靶向空间蛋白组学和多重免疫荧光成像。它在同一张组织切片上检测预选蛋白，并保留染色信号的组织位置。图像经配准、分割和定量后，可整理为单细胞的蛋白强度、形态与空间坐标。[1]

其检测靶标由抗体面板确定。DNA 条形码承担区分抗体与组织读出轮次的功能，蛋白信号由抗体对抗原的识别产生。研究使用的 marker 数量随面板设计改变，例如 CANVAS 使用 41-plex 面板，IDH 突变胶质瘤研究使用 61-marker 面板。[2][3]

检测原理与循环读出

抗体、条形码与荧光 reporter

后续标准化方案使用三类相互配合的组分：

组分 作用 对应信息
识别蛋白的抗体 与组织内相应抗原结合 决定所检测的蛋白
抗体连接的 DNA 条形码 提供可被特定 reporter 识别的序列 区分不同抗体
带荧光的互补 reporter 寡核苷酸 与对应条形码杂交，在该轮显示荧光 将所选蛋白转化为可成像信号

多种抗体先共同结合组织，每轮再选择少数 reporter 显示对应标志物。循环使用有限的荧光通道，使同一切片能够读出较大的抗体面板。[1:1]

一个完整的检测流程

  1. 设计面板并准备组织。
    1. 根据细胞类型和状态的研究问题选择抗体，核查各抗体在目标组织和处理条件下的染色表现。
    2. 按所用方案准备组织切片、进行抗原处理，并完成 DNA 标记抗体的共同染色。
  2. 读出一组标志物。
    1. 加入本轮带荧光的 reporter，使其与所选抗体的 DNA 条形码杂交。
    2. 采集荧光图像，同时保留用于跨轮配准的参考信号。
  3. 重复循环读出。
    1. 去除本轮 reporter，保留已结合组织的抗体。
    2. 加入下一组 reporter，继续成像，直至完成面板读出。
  4. 整合多通道图像。
    1. 拼接视野，配准各轮图像，使不同 marker 对应同一组织位置。
    2. 按分析方案进行背景处理，形成后续分割与定量的多通道图像。[1:2]

原始 CODEX 与后续方案

2018 年原始 CODEX 使用聚合酶驱动的荧光核苷酸掺入，实现各轮的条形码显现。后续标准化 CODEX 方案采用带荧光的互补 reporter 杂交、成像和去除循环。两者共享 DNA 编码抗体与循环读出的思想，具体显色化学分别沿用各自方案。PhenoCycler-Fusion 是后续商业化平台中的一种实现。[4][1:3][5]

典型多通道组织图与读图

下图取自 CANVAS 研究的非小细胞肺癌组织，展示同一组织视野中的多种蛋白染色及细胞核位置。图中选择部分通道进行叠加，完整研究面板包含 41 个 marker。[2:1]

CANVAS Figure 2I｜典型 CODEX 多通道组织图与局部放大
Figure 2I｜代表性 CODEX 组织图。左图为 B 细胞—肿瘤—细胞毒性 T 细胞构型，右图为细胞毒性 T 细胞—肿瘤—成纤维细胞构型。圆形插图分别放大标记为 1、2 的区域。原图比例尺均为 50 μm。来源：CANVAS 原论文 Figure 2I，PDF 第 5 页。[2:2]

读图时可以依次关注三类信息：

  1. 蛋白通道与颜色。
    1. 左图中 CD8 为青色、CD20 为蓝色、FAP 为橙色、CD31 为红色，E-cadherin 为白色，DAPI 为灰色。
    2. CD8 和 CD20 支持识别相应的淋巴细胞群，FAP、CD31 和 E-cadherin 分别提供成纤维、血管和上皮相关结构信息，DAPI 标记细胞核。
    3. 颜色是所选通道的可视化编码。左右图的蓝色分别对应 CD20 与 CD3e，解释时使用各图自己的图例。
  2. 染色所在的细胞区域。
    1. 核染色帮助定位细胞，膜或其他区域的蛋白染色显示信号的形态与分布。
    2. 局部放大保留邻近细胞及其信号位置，为理解细胞掩膜的划定和信号汇总提供直观依据。
  3. 组织内的相对位置。
    1. 图像保留了免疫细胞、肿瘤相关结构和基质的局部排列。
    2. 进一步的细胞类型、距离和邻域统计由分割、定量与注释流程计算得到。[2:3]

从多通道图像到单细胞数据

数据层级与计算单位

CODEX 的分析链包含图像测量和后续计算两个层次。各层输出具有明确的对象与用途：

层级 对象与输出 获得方式
多通道图像 每个位置在各 marker 通道中的荧光信号 组织染色、循环成像和图像整合
细胞分割 每个细胞或细胞核的掩膜 从核染色及所选通道识别细胞范围
单细胞定量 细胞 × marker 强度矩阵、质心和形态特征 在各分割区域内汇总图像信号
细胞类型与状态 每个细胞的生物学标签 门控、聚类及标志物解释
空间邻域 指定距离或相邻规则下的细胞组成与分布 结合坐标、细胞标签和邻域定义

其中，“细胞 × marker”表以分割得到的细胞对象为单位。不同研究可能采用细胞核、细胞核扩张区域或更完整的细胞掩膜，具体区域会影响所汇总的膜、胞质与核内信号。[1:4][2:4][3:1]

细胞分割如何产生表达矩阵

  1. 界定细胞范围。
    1. 核染色提供细胞核位置，分割算法将图像中的细胞核赋予独立编号。
    2. 根据方案扩张核区域或结合其他通道估计细胞范围，生成细胞掩膜。
  2. 逐 marker 汇总信号。
    1. 对一个细胞，提取其掩膜内对应通道的像素值。
    2. 计算平均强度等所选汇总指标，将该值写入该细胞、该 marker 的位置。
  3. 保留空间与形态信息。
    1. 从掩膜计算质心、面积和其他形态特征。
    2. 以相同细胞编号关联图像、强度矩阵和坐标表，形成可追踪的数据对象。[1:5]

CANVAS 研究采用细胞掩膜内的平均荧光强度，计算方式可以表示为：

细胞的 marker 平均强度=该细胞掩膜内该通道的像素强度总和该掩膜包含的像素数\text{细胞的 marker 平均强度} =\frac{\text{该细胞掩膜内该通道的像素强度总和}} {\text{该掩膜包含的像素数}}

这个均值概括所选细胞区域的染色强度。抗体结合、组织处理、背景、曝光与信号汇总范围共同影响数值，跨样本比较通常需要相应的对照和归一化设计。蛋白的绝对丰度定量需要专门的校准。[2:5][6]

细胞注释与空间分析

强度、阳性评分与细胞标签

单细胞蛋白强度可经过变换和标准化，作为降维、聚类及门控的输入。细胞类型由多个 marker 的组合和聚类特征解释，例如 CD3 联合 CD4、CD8 支持 T 细胞及其亚群注释，核内或状态相关标志物支持进一步的状态区分。[1:6][3:2]

Nimbus 提供另一类输入：根据蛋白图像及分割掩膜，为每个细胞、每个 marker 计算 0–1 的阳性评分。该评分、原始染色强度和最终细胞类型分别属于模型判定、图像测量与生物学注释三个层次。不同分析流程可按任务选择强度或阳性评分。[3:3]

邻域、距离与组织区域

空间分析先定义所研究的关系，再结合细胞坐标与标签计算：

  1. 细胞局部组成。
    1. 以一定半径、最近邻数量或图上的相邻关系选取邻近细胞。
    2. 统计各类型的数量或比例，描述该细胞所在的局部环境。
  2. 细胞间空间关系。
    1. 汇总细胞类型之间的距离、相邻频率或共定位程度。
    2. 通过合适的参考或置换模型评价空间富集，结果对应所定义尺度下的组织关系。
  3. 组织区域分析。
    1. 结合病理区域标签或空间组成划分组织环境。
    2. 比较区域内的细胞组成、状态分布和边界变化。[2:6][3:4]

这些分析的计算对象包括细胞、细胞对、邻域和组织区域。群体比较同时保留患者、样本和切片的来源信息，以与研究设计中的独立观察单位对应。

应用实例

CANVAS：空间蛋白图谱与细胞邻域

CANVAS 研究使用 PhenoCycler-Fusion 2.0 和 41-plex 面板，在非小细胞肺癌组织中建立空间蛋白图谱。研究先依据蛋白特征注释 15 类主要细胞群，再根据局部细胞组成建立 10 类 cellular neighborhood，随后将这些空间标签用于 H&E 图像模型训练。41、15 和 10 分别对应该研究的蛋白面板、细胞分类与邻域分类。[2:7]

CANVAS Figure 1F｜细胞类型与标志物分类示意
Figure 1F｜CANVAS 研究的细胞分类示意。图中按上皮、免疫和基质等类别组织细胞类型，并列出支持分类的代表性标志物，体现蛋白特征到细胞标签的解释过程。[2:8]

面板覆盖肿瘤及上皮、免疫、成纤维与血管相关细胞标志物，并包含增殖、缺氧及其他功能状态标志物。细胞标签与空间邻域由后续分析形成，成像为其提供蛋白信号和位置。[2:9]

IDH 突变胶质瘤：阳性评分与状态注释

IDH 突变胶质瘤研究使用 61-marker CODEX 面板。作者通过 DAPI 与 CellPose 分割细胞核，并采用核扩张等策略汇总信号，随后计算 Nimbus 评分。主要类型先由标志物门控赋值，剩余待分类细胞通过代表性核内蛋白强度进行 SOM 聚类，T 细胞、髓系与血管细胞的细分采用相关 marker 的 Nimbus 评分。[3:5]

该例体现了三个依次衔接的环节：CODEX 获得多通道蛋白图像，分割与定量将其落实到细胞，门控和聚类解释细胞类型与状态。图 2A 再按“样本—细胞类型”汇总 Nimbus 评分，并进行相对差异计算与 z 标准化，具体公式见 Nimbus 标志物阳性评分。

与相关技术的比较

方法 主要检测对象 标志物选择方式 空间信息与常用分析单位
常规 IHC 或多重 IF 蛋白 预选抗体 保留组织位置，按像素、细胞或区域分析
CODEX 多种蛋白 DNA 编码的预选抗体面板 保留组织位置，经分割获得单细胞数据
流式细胞术 蛋白及所选细胞指标 预选抗体或探针 解离后的单细胞，常用于细胞指标与群体比例分析
单细胞 RNA 测序 RNA 按建库方案测量转录本 以细胞为单位，组织位置通过另行关联获取
空间转录组 RNA 全转录组或靶向探针面板 保留空间位置，分析单位可为 spot、像素或分割细胞

CODEX 与转录组方法分别提供蛋白和 RNA 层面的信息。联合分析时，样本匹配、切片关系和测量单位决定可以开展的对应比较，细胞标签与空间结构的对应由具体整合方案建立。[1:7][3:6]

实验质量与结果解释

  1. 面板与组织条件。
    1. 抗体特异性、组织固定和抗原处理决定各 marker 的可检测表现，面板内抗体需要在对应条件下验证。
    2. 阴性与阳性对照、背景处理及批次信息支持染色强度的解释和样本间比较。
  2. 循环图像与细胞掩膜。
    1. 视野拼接、跨轮配准和信号背景影响不同通道在同一细胞中的对应关系。
    2. 对代表性区域叠加检查分割掩膜与核、膜或胞质染色，可评价定量范围及邻近细胞信号的影响。
  3. 分析尺度与生物学含义。
    1. 细胞分割规则、强度变换、注释方法及邻域尺度共同定义所报告的空间结果。
    2. 常规切片结果描述所成像的二维组织截面，连续切片与三维成像可扩展对立体结构的评价。[1:8]

相关条目

  1. Nimbus 标志物阳性评分：从图像与分割评估标志物阳性表现。
  2. 肿瘤微环境：肿瘤、免疫、基质与血管细胞构成的组织环境。
  3. 配受体分析：根据表达特征研究候选细胞通讯，与空间关系分析提供互补信息。

参考来源

  1. Black S 等。CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies。Nature Protocols，2021。DOI，PMC 全文。用于 reporter 杂交流程、组织成像与单细胞分析、抗体验证和质量因素。 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  2. Li 等。CANVAS 研究，Cell，2026。DOI。具体应用来自原文 Figure 1、Figure 3 及 Methods，详见对应学习页。41-plex、PhenoCycler-Fusion 2.0、15 类细胞与 10 类邻域为该研究的具体设置。 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  3. Hoefflin 等。Spatial analysis reveals the evolving organization of IDH-mutant glioma。Cancer Cell，2026。DOI。用于 61-marker 面板、CellPose 分割、Nimbus 与 SOM 分析，以及空间区域和邻域应用。原文 PDF 第 17–18 页 Spatial proteomics analysis。 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  4. Goltsev Y 等。Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging。Cell，2018。DOI。用于原始 CODEX 的 DNA 编码与聚合酶显色方案。 ↩︎

  5. Akoya Biosciences。Technical Note: PhenoCycler Solutions，DN-00140 Rev A，2022。官方技术文件。用于商业化面板的抗体验证背景。 ↩︎

  6. Hickey JW 等。Strategies for Accurate Cell Type Identification in CODEX Multiplexed Imaging Data。Frontiers in Immunology，2021。DOI，PMC 全文。用于抗体、曝光、背景和强度归一化的解释。 ↩︎